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PCR:即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，利用DNA 在體外95°C時(shí)解旋(變

性)，55°C時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合(退火)，再調(diào)溫度至72°C左右, DNA

聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補(bǔ)鏈(延伸)

PCR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在95'C, 55°C, 72°C之間很好地進(jìn)行溫度控制。根

據(jù)DNA擴(kuò)增的目的和檢測的標(biāo)準(zhǔn)可以將PCR儀分為:普通PCR儀，梯度PCR儀，原位PCR

儀，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等幾類。

普通PCR儀:

-般把一次PCR擴(kuò)增只能運(yùn)行一個(gè)特定退火溫度的PCR儀，稱之為普通PCR儀，也就是傳統(tǒng)的PCR儀。如果要用它做不同的退火溫度則需要多次運(yùn)行。

普通PCR儀主要應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)、檢疫等。

梯度PCR儀:

PCR反應(yīng)能否成功，退火溫度是關(guān)鍵，梯度PCR儀每個(gè)孔的溫度可以在指定范圍內(nèi)按照梯度設(shè)置，根據(jù)結(jié)果，-步就可以摸索出最適反應(yīng)條件。-次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置-系列不同的退火溫度條件(通常12種溫度梯度)的稱之為梯度PCR儀。

不同的DNA片段其最適合的退火溫度不同，通過設(shè)置-系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次性PCR擴(kuò)增就可以篩選出表達(dá)量高的最適合退火溫度進(jìn)行有效的擴(kuò)增。

梯度PCR儀主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣既節(jié)約時(shí)間，也節(jié)約成本。在不設(shè)置梯度的情況下亦可當(dāng)做普通的PCR用。

梯度PCR儀多應(yīng)用于分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)、司法科學(xué)、生物技術(shù)、環(huán)境科學(xué)、微生物學(xué)、臨床診斷、流行病學(xué)、遺傳學(xué)、基因芯片、基因檢測、基因克隆、基因表達(dá)等領(lǐng)域以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( Picymerase Chain Reaction，PCR為特征的、以檢測DNA/RNA為目的的各種病原體檢測及基因分析。

原位PCR儀

PCR是提取細(xì)胞或組織中的DNA進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，而原位PCR是保持細(xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增。

不但可以檢測到靶DNA，而且還可以了解靶DNA存在于何種細(xì)胞中，更有利于探討靶DNA與細(xì)胞之間的關(guān)系。

原位PCR儀主要應(yīng)用于：（1）檢測外源性基因片段，提高檢出率，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）觀察病原體在體內(nèi)分布規(guī)律；（3）內(nèi)源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等；（4）檢測導(dǎo)入基因；（5）遺傳病基因檢測如β－地中海貧血。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀:

在普通PCR儀設(shè)計(jì)基礎(chǔ).上增加熒光信號(hào)采集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，形成了具有熒光定量功能的PCR儀器。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR擴(kuò)增原理相同，在PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過熒光信號(hào)采集系統(tǒng)實(shí)時(shí)采集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。

熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當(dāng)只用-種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候，選用單通道;有多種熒光標(biāo)記的時(shí)候使用多通道。單通道也可以檢測多熒光的標(biāo)記和目的基因表達(dá)產(chǎn)物，因?yàn)橐淮沃荒軝z測一種目的基因的擴(kuò)增量,需多次擴(kuò)增才能檢測完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR,實(shí)現(xiàn)一次檢測多種目的基因的功能。

熒光定量PCR儀主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。熒光定量檢測技術(shù)在臨床診斷方面很多，主要集中在各種病原體引起疾病的臨床診斷，如肝炎類疾病、性病、與優(yōu)生優(yōu)育相關(guān)的疾病以及肺結(jié)核等等。

通道: channel指的是針對(duì)每一種熒光的檢測器，比如你在-一個(gè)管中做多個(gè)顏色，針對(duì)多個(gè)靶基因。每個(gè)顏色需要-個(gè)檢測器來檢測熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，每一個(gè)針對(duì)不同顏色的檢測器，就是一個(gè)通道。在使用有些廠家5通道的熒光定量儀時(shí)，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性和準(zhǔn)確性都要在實(shí)驗(yàn)中使用ROX(一種熒光染料，ROX是作為內(nèi)參的，即參照和校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在ABI的機(jī)器里顯示為紅色的水平線。如果你的擴(kuò)增線在剛開始的時(shí)候就高于ROX證明有基因組DNA污染。)或?qū)Ｓ玫?/font>Referencedye，這些熒光染料都必須單獨(dú)使用-個(gè)檢測通道。這樣以來，真正能檢測多重PCR熒光信號(hào)的有效通道只有4個(gè)，而且使用校正染料可能會(huì)增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測通道是只為自己廠家的專用的熒光染料或試劑開放的，有效檢測通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。

選擇單通道實(shí)驗(yàn)還是多通道實(shí)驗(yàn)？

這是要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要來選擇的，如果有一個(gè)、兩個(gè)或是三個(gè)基因要進(jìn)行比較,并用看家基因進(jìn)行對(duì)照，可以考慮選擇多通道實(shí)驗(yàn)。多通道實(shí)驗(yàn)的好處是可以消除樣本加樣的誤差。但要克服的困難也比較多，一是條件的優(yōu)化比較麻煩，即多種PCR反應(yīng)以及探針要在同一個(gè)反應(yīng)條件下進(jìn)行，并且效率都要比較，高，另一個(gè)困難是要求相互之間沒有干擾，因?yàn)楦蓴_會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果。還有一一個(gè)困難是當(dāng)一個(gè)基因的模板數(shù)顯著大于其他基因時(shí)，因?yàn)楣灿煤艘羲岬荣Y源的原因，會(huì)讓模板數(shù)少的基因的定量值變小或變?yōu)榱恪Ｒ虼艘话銉赏ǖ赖膶?shí)驗(yàn)比較多些，即一個(gè)基因進(jìn)行多樣本比較，用看家基因進(jìn)行對(duì)照。

硬件設(shè)計(jì):傳統(tǒng)的96孔板的熒光定量PCR可以容納的樣本量大，而且無需特殊的耗材。有些傳統(tǒng)的96孔板的儀器采用鹵鎢燈激發(fā)、CCD檢測，這些光學(xué)結(jié)構(gòu)在96孔板的頂部，每個(gè)樣品孔距光源和檢測器的光程各不相同一-邊緣效應(yīng)，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。為了保證精確、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這類儀器在實(shí)驗(yàn)過程中通常會(huì)使用ROX (-種熒光染料)或?qū)Ｓ玫?/font>Reference dye作為參照校正實(shí)驗(yàn)結(jié)果。鹵鎢燈的使用壽命短、更換成本較高已經(jīng)成為很多用戶頭痛的問題。在實(shí)驗(yàn)過程中鹵鎢燈作為一種熱光源，產(chǎn)生較多熱能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的影響。CCD最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以同時(shí)掃描所有樣品中的熒光信號(hào)，但是靈敏度較低，而且同時(shí)檢測樣品間的熒光信號(hào)存在干擾。像ABI、Bio-rad 公司生產(chǎn)的熒光定量PCR就屬于這一種。

創(chuàng)新的離心式的儀器通常選用LED激發(fā)、PMT檢測，離心式的設(shè)計(jì)上避免了邊緣效應(yīng)。LED光源是冷光源對(duì)實(shí)驗(yàn)沒有影響，因此無需采用其他熒光染料校正儀器，而且使用壽命長無需經(jīng)常更換。PMT每次只能收集.單個(gè)熒光信號(hào)，但是檢測靈敏度高。但這類儀器運(yùn)行速度非常快，但也存在樣本量小、耗材昂貴、沒有梯度功能、存在時(shí)間積分等缺點(diǎn)。Corbett 的Rotor-gene系列和Roche的Lightcycler 系列均為這一.類儀器。